При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окра­шиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцве­чивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафра­нином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отра­зиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы оста­лся необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам кон­трольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно нали­вать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом сте­кающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По дан­ным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнитель­ная окраска фуксином Пфейффера.

studfiles.net

Мир науки

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).

3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.

Page 2

Основной функцией белков главного комплекса гистосовместимости является представление антигенных пептидов в такой форме, в которой их могут распознать рецепторы Т-клеток. Как именно антигенный пептиды попадают в

Подробнее: Процессинг и презентация антигена

Содержимое клеток можно извлечь, растирая ткань между вращающимися стеклянными поверхностями (гомогенизация) или при помощи различных химических методов, разрывая плазматическую мембрану.

Подробнее: Органеллы клеток - биология

Плазмалемма не только образует барьер между вне- и внутриклеточном жидкостями, но и участвует в межклеточных взаимодействиях, формирующих ткани организма. Некоторые клетки, например в крови, не связаны друге другом, а плавают в жидкости (плазме и г. и).

Подробнее: Межклеточные контакты - биология

worldofscience.ru

Исследование морфологических свойств микробов

Приготовление фиксированного препарата и окраска его по Граму

А. Приготовление фиксированного препарата.

Препараты бактерий готовят на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не превышающую 1,2-1,4 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена. В повседневной работе достаточно натереть сухое чистое стекло сухим хозяйственным мылом, после чего тщательно протереть сухой хлопчатобумажной салфеткой; на хорошо обезжиренном стекле капля воды равномерно расплывется (не сохраняет каплевидную форму).

На обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды и переносят в неё профламбированной (стерильной) биологической петлей незначительное количество исследуемого материала. Биомассу бактерий вращательным движением петли растирают в капле воды на площади примерно 4 см 2. Слой должен быть настолько тонким, что мазок высыхает почти сразу после приготовления.

Высушивание мазка следует проводить при комнатной температуре на воздухе. Если оно замедлено, то препарат можно слегка нагреть в токе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая препарат, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация мазка преследует несколько целей: убить микроорганизмы, приклеить их к стеклу, обеспечить лучшее окрашивание. Для того, чтобы зафиксировать мазок, нужно три раза провести предметное стекло через самую горячую часть пламени горелки, держа его мазком вверх.

Б. Окраска препарата по Граму.

На зафиксированный мазок помещают фильтровальную бумажку и наносят краситель генцианвиолет на 1,5-2 мин. (на этой стадии операции необходимо следить, чтобы краситель проходил на мазок через фильтр). Далее фильтровальную бумагу убирают и наносят на мазок раствор Люголя также на 1,5-2 мин. Раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96%-м этиловым спиртом в течение 30 сек. Затем мазок промывают водой, докрашивают фуксином Циля (1,5-2 мин.) и промывают водой до «светлой капли». Далее мазок высушивают, наносят на него иммерсионное масло и изучают в микроскопе при увеличении объектива 90х.

Методы исследования живых клеток

А. Препарат «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в неё небольшое количество культуры изучаемых микроорганизмов. Взвесь бактерий размешивают и прикрывают покровным стеклом. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой, которую затем следует сразу опустить в дезинфицирующий раствор.

Б. Препарат «висячая капля».

Каплю суспензии микроорганизмов биологической петлей наносят на покровное стекло, которое затем переворачивают каплей вниз и помещают над лункой специального предметного стекла (стекло с лункой). Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.

В. Препарат «отпечаток»

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат (покровное стекло) помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.

Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе.

Цитохимические методы исследования строения микробов

А. Окраска капсул и приготовление красителей

а) Окраска капсул

Для окраски капсул применяют методы Михина, Ольта, Ребигера, Романовского-Гимза, Гинса, негативный метод Бурри.

Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлёра в течение 2-3 мин. при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги. Клетка окрашивается в темно-синий цвет, капсула - в светло-розовый.

Метод Ольта. Фиксированный препарат окрашивают 2-3%-м водным раствором сафраина в течение 1-3 минут (лучше при подогревании) и быстро промывают водой. Раствор сафраина готовят перед употреблением, растворяя краску в воде, доведенной до кипения, затем фильтруют через бумажный фильтр. Клетки окрашиваются в красно-коричневый цвет, капсулы - в бледно-желтый.

Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно формалиновым раствором генцианвиолета. Нефиксированные мазки окрашивают 15-20 сек., быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы - в красновато-фиолетовый.

Метод Романовского-Гимза. Краску фабричного приготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Разведенную краску наливают на дно чашки Петри, в которую кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, зафиксированный метиленовым спиртом, помещают в чашку до соприкосновения с краской (бактерии находятся на нижней плоскости мазка). Окрашивание проводят 30-40 минут. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Клетки окрашиваются в сине-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвета.

Негативный метод Бурри. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши, разведенную в 10 раз дистиллированной водой. В тушь вносят каплю исследуемой культуры и хорошо смешивают. Полученную взвесь другим стеклом равномерно распределяют по поверхности предметного стекла, высушивают на воздухе. Препарат рассматривают с иммерсией. На темно-дымчатом фоне хорошо видны неокрашенные капсулы и клетки бактерии.

Метод Гинса. На край предметного стекла наносят каплю туши, вносят в неё клетки, хорошо перемешивают и ребром другого стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5-10 минут жидкостью Никифорова или 3 минуты абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивается фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2-3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией. На темно-сером фоне выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.

Окраска капсул бактерий по Муромцеву. На фиксированный мазок наносят краситель Муромцева на 30-40 сек., мазок промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина - капсулы розовые, бактерии - темно-синие.

б) Приготовление красителей для окраски капсул.

Синька Леффлера. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-го этилового спирта.

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-го раствора КОН.

Раствор КОН: 0,01 г КОН развести в 99,99 мл дист. воды.

Раствор сафраина. 3 г сафраина смешать с 97 мл дистиллированной воды, довести до кипения, профильтровать. Краска готовится перед употреблением.

Формалиновый раствор генцианвиолета. 15-20 г генцианвиолета растворить в 100 мл 40%-го формалина, оставить на 6-8 часов при комнатной температуре, профильтровать, после чего он готов к употреблению.

Краситель Романовского-Гимза. Готовый реактив разводят перед употреблением: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Смесь Никифорова. Этиловый спирт и серный эфир в равных объемах.

Комбинированная краска по Муромцеву. Первый раствор - фуксин основной - 0,15 г, спирт этиловый 96%-й - 20 мл, карболовая кислота кристаллическая (фенол) - 10 г. Второй раствор - метиленовый голубой - 2,5 г, вода дистиллированная - 200 мл. Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.

Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость связана с особенностью химического состава клеточной стенки этих бактерий: в ней содержится много сложных липидов и миколовых кислот.

На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На препарат помещают фильтровальную бумагу и заливают карболовым фуксином Циля и затем 2-3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку; при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ой серной кислотой. Для этого предметное стекло 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 минут синькой Леффлера. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсией. Кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.

Реактивы для определения кислотоустойчивости.

Фуксин Циля. 5 %-й раствор свежеперегнанного фенола 100%, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь отфильтровывают через 48 часов. Краситель устойчив при хранении.

Другой способ получения фуксина Циля: фуксин основной - 1 г, фенол кристаллический - 5 г, спирт 96 %-й - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле, затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

В. Окраска спор и приготовление реактивов.

а) Окраска спор

Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.

Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простой обработке препарата спорообразующих бактерий фуксином или генцианвиолетом споры не окрашиваются. При микроскопировании они обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. Свободные споры имеют вид колец.

Метод Пешкова. Мазок готовят на обезжиренном предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленовой сини по Леффлёру. Краситель доводят до кипения, держа стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, - 10-20 сек. Затем предметное стекло охлаждают, тщательно промывают водой и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафраина. Краситель сливают, мазок промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры - синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать другой краситель - малахитовый зеленый. В этом случае фиксированный препарат заливают на 7-10 минут 7,5%-м раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают и докрашивают 0,25%-м водным раствором сафраина в течение 1-2 минут. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.

Метод Циля - Нильсена в модификации Мюллера. На фиксированный над пламенем мазок наливают 5%-й водный раствор хромовой кислоты, которую через 5-10 минут смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров, но не до кипения, потом отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя (так в течение 7 минут). При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения мазка её снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Поэтому для обесцвечивания цитоплазмы препарат затем обрабатывают 1%-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 секунд. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. Затем препарат промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получиться контрастной и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

б) Реактивы для окрашивания спор бактерий

1. Карболовый фуксин Циля (см. выше).

2. Метиленовый синий Леффлёра (см. выше).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего: 2 г красителя растворить в 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.

5. Кислота соляная или серная, 1%-й раствор.

6. Сафраин, водный раствор: 2,5%-й раствор сафраина в 96%-м этаноле - 10 мл, вода дистиллированная - 100 мл.

7. Малахитовый зеленый: малахитгрюн - 7,5 г, вода дистиллированная - 92,5 мл.

8. Метиленовый синий насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий - 3 г, 96%-й спирт - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают, потом фильтруют. Раствор устойчив.

9. Метиленовый синий по Леффлёру (другой рецепт): 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего растворить в 100 мл дистиллированной воды, добавить 1 мл 1%-го водного раствора КОН.

Г. Окраска жгутиков

а) Приготовление препарата

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает толщину жгутиков. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается в диаметре и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки культуры и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании культуры.

Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы культуры на свежую питательную среду в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды. Кроме того, в день просмотра можно брать петлей материал и переносить в пробирку с 5-6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется болтать петлей в воде, бактериальная масса сама должна в течение 30-60 мин разойтись в ней.

Прежде чем приступить к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1,5-2 суток.

Для приготовления препаратов необходимы совершенно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-м спиртом. Пред приготовлением мазка следует сильно нагреть ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, но наносить его надо на охлажденное стекло.

б) Методы окрашивания.

Метод Леффлёра. Суспензию бактерий наносят на стекло пастеровской пипеткой или петлей (3-4 маленьких капли) и сушат при комнатной температуре. Допускается фиксация мазка быстрым одноразовым проведением через пламя. Далее препарат заливают протравой на 3-5 минут при нагревании до появления паров или 15-20 минут при комнатной температуре, потом промывают сильной струей дистиллированной воды 30 сек. и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат карболовым фуксином Циля 3-4 минуты при легком нагревании до появления пара (фуксин содержит 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды, или в соотношении 1:1). Затем препарат промывают водой и исследуют с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Метод Фонтана. В пробирку с 0,5 мл стерильной водопроводной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, слегка касаясь культуры, а не вести биологической петлей по поверхности агара. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 час. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят на обезжиренное предметное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 минут жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой (см. ниже) и подогревают стекло до появления паров в течение 2 минут. Протраву сливают, препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением: разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2-х минут до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики (часто спутанные) - в светло-коричневый или желтый.

Метод серебрения жгутиков по Морозову. Препарат готовится, как описано выше. На препарат наливают на 1 минуту реактив №1. Затем его сливают, промывают водой и наливают реактив №2. Подогревают на слабом пламени до появления паров, тщательно промывают водой и 1-2 минуты (при подогревании) обрабатывают препарат реактивом №3 до появления темно-коричневой окраски мазка. Мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

в) Реактивы для окраски жгутиков.

Приготовление протравы: 12 г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного раствора железного купороса FeSO4 и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-м спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед употреблением фильтруют.

Краситель: карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят перед употреблением и фильтруют.

Реактив №1: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл формалина 40%-го, 100 мл дистиллированной воды. Это жидкость Руге.

Реактив №2: протрава - танин (5 г), фенол кристаллический (1 г) и дистиллированная вода (100 мл).

Реактив №3 (реактив для серебрения): азотнокислое серебро - 5 г, раствор аммиака, вода дистиллированная - 100 мл. К 3-4 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра по каплям прибавляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторожно до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой в 10 раз.

Д. Окраска включений клеток микроорганизмов

Окраска гликогена. Гликоген - животный крахмал часто накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для выявления гликогена к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют гранулы гликогеноподобных веществ, окрашенные в красновато-коричневый цвет.

Окраска гранулёзы. Гранулеза - крахмалоподобное вещество. Гранулеза в больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Анализ проводят аналогично выявлению гликогена. Гранулеза окрашивается в синий цвет.

Окраска жира. Жир содержится в клетках почти всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 минут добавляют каплю метиленового синего и спустя 10 минут каплю судана III - индикатора жироподобных веществ. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашиваются в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.

Бактерии в качестве резервных липидов образуют гранулы поли-бета-оксимасляной кислоты. Для их выявления готовят фиксированный мазок, окрашивают суданом черным или суданом III в течение 5-15 минут (краситель при этом может высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него препарат. Время просветления препарата в ксилоле не должно превышать 1 минуту. После этого клетки дополнительно окрашивают 0,5%-м раствором сафранина в течение 5-10 сек. Включения поли-бета-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.

Окраска полифосфатов (волютин, метахроматин). На тонкий, зафиксированный на горелке мазок, наносят метиленовую синь по Леффлеру и окрашивают в течение 10 минут. Краситель сливают, промывают, просушивают, микроскопируют с иммерсией. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютин - в фиолетово-красный.

Окраска волютина по Омелянскому. На фиксированный в пламени мазок наносят фуксин Циля и окрашивают клетки 0,5-1 минуту. Промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором серной кислоты в течение 20-30 сек. Кислоту сливают, мазок промывают водой и дополнительно докрашивают метиленовым синим (в разведении 1:40) 20-30 сек. Препарат вновь промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Окраска волютина по Муромцеву. Тонкий фиксированный смазок культуры микроба окрашивают краской по Муромцеву 1 минуту. Мазок промывают водой, сушат и микроскопируют с иммерсией. Зёрна волютина окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма - в голубой.

Препараты для окрашивания включений.

1. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 3 г, вода дистиллированная - 300 мл.

2. Судан III - 0,5 г, молочная кислота концентрированная - 100 мл.

2-а. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.

3. Судан черный В - 0,3 г, 100 мл 70%-го горячего этилового спирта. Раствор выдерживают несколько часов в закупоренной склянке при 60°С, затем охлаждают и фильтруют.

4. Метиленовый синий 1:40. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего - 1 мл, вода дистиллированная - 40 мл.

Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов

а) Методы выявления

Метод Романовского-Гимза. Препарат фиксируют метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают этиловым спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (pH 7,2), высушивают и микроскопируют с иммерсией. Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.

Реакция Фельгена. Препарат обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 5 мин., промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 минут в растворе 1н. соляной кислоты, подогретой до 60°С, погружают на 1-2 минуты в холодную 1н. соляную кислоту и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3-4 часа. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 минут в каждой, затем споласкивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Ядерное вещество окрашивается в фиолетовый цвет.

Модификация метода Фельгена. После гидролиза в соляной кислоте препарат немедленно промывают водой и помещают на 15 минут в 1%-й раствор формалина. Вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 минут 0,1-1%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают, исследуют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.

б) Реактивы для выявления нуклеоида.

1. Фиксатор Карнуа: 96%-й этиловый спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл (время фиксации - 15 минут).

2. Краситель Романовского-Гимза: состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Перед употреблением к 10 мл красителя добавляют 10 мл дистиллированной воды (pH 7,2).

3. 1н. соляная кислота.



biofile.ru

5Окраска по Граму. Методика:

окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты,через фильтровальную бумагу);

бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

тщательно смыть спирт водой;

окрасить водным фуксином (2 минуты);

промыть водой и высушить.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

тщательно промыть водой;

окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.

нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

слить кислоту, промыть водой, высушить;

зафиксировать в пламени;

окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

• Окрасить раствором Люголя (30 секунд);

  Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)

  Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.

Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Окраска по Граму

Овчаровой Анны Игоревны

студентки 3 курса,

специальность «Биология»

Минск, 2016

Введение

1. Техника проведения окраски

1.1 Подготовка материала для окраски

1.2 Фиксация

1.2.1 Физический способ фиксации

1.2.2 Химический способ фиксации

1.3 Процесс окрашивания мазков

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

2.1 Модификация Hucker

2.2 Модификация Burke

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

2.4 Модификация Preston-Morrell

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ВВЕДЕНИЕ

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс.

При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки. Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000.

Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак (биологический сигнал). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов, вырабатываемых Clostridium difficile .

Окраску по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ, синовиальной, плевральной и перитонеальной жидкости. Нижний предел чувствительности метода составляет 10000 бактерий на 1 мл.

Чтобы увеличить чувствительность, исследуемую жидкость центрифугируют и готовят окрашенный мазок осадка. Эта процедура называется обогащением материала. Она проста и особенно ценна для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ и кислотоустойчивых бактерий в мокроте.

1. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ОКРАСКИ

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой -- дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (?) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легкоразрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

1.1 Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

1.2 Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваютсялучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

1.2.1 Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксациидолжен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметногостекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стеклодолжно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70--80 °С).

1.2.2 Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % -- 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10--15 минут и затем высушивают на воздухе.

1.3 Процесс окрашивания мазков

1 На фиксированный мазок наливают один из осномвных красителей на 2 или 3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

1. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1--2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1--2 минуты до почернения препарата.

2. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20--40--60 секунд).

3. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1--2 мин.

4. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2--5 мин).

5. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.

2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.

5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.

6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.

7. Промокают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 -- 2 мл); растворы сливаютдо тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.

9. Проводят через 3 смены ксилола

10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

2.1 Модификация Hucker

гистологический окрашивание бактерия

2.2 Модификация Burke

2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b (2-3 мин).

4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить).

7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек).

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют.

2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более).

3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).

4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать.

5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).

6. Препарат высушить на воздухе.

7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин).

8. Промыть и подсушить препарат.

2.4 Модификация Preston-Morrell

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин).

2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).

3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).

4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить.

5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить.

6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек).

7. Промыть и подсушить препарат.

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)	· Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором · Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие · Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культура	· Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условиях	· При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой · Культивируйте микроорганизм на полноценной среде

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)	· Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении · Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной "густотой" мазка · Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади · При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
Мазок плохо обесцвечен	· Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием · Повторить приготовление препарата и его окраску · Дообесцветить имеющийся мазок · Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки - заменить раствор.
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Особенности строения клеток бактерий, постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки и принципы их окраски по Граму. Пропионово-кислое брожение и способы питания микроорганизмов. Санитарная оценка масла по микробиологическим показателям.

контрольная работа , добавлен 21.10.2010


Определение назначения и описание механизма гистохимических методов идентификации химических веществ в гистологических срезах. Описание электронной, люминесцентной и ультрафиолетовой микроскопии. Радиоавтография и культура клеток и тканей вне организма.

реферат , добавлен 09.09.2014


Техника приготовления гистологических препаратов для световой микроскопии, основные этапы данного процесса и требования к условиям его реализации. Методы исследования в гистологии и цитологии. Примерная схема окраски препаратов гематоксилин – эозином.

контрольная работа , добавлен 08.10.2013


История систематического изучения закономерностей эволюции тканей. Теория параллелизма гистологических структур. Теория дивергентной эволюции тканей. Теория филэмбриогенеза в гистологии. Эпителиальная, производные мезенхимы, мышечная и нервная ткань.

презентация , добавлен 12.11.2015


Слоистые каменные структуры (строматолиты) - результат жизнедеятельности бактерий как древнейшей группы организмов. Изучение бактерий, форма и строение бактерий, их размеры и распространение. Классификация бактерий по способу питания, размножение.

презентация , добавлен 14.10.2011


Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.

презентация , добавлен 23.02.2016


Разделение водорослей на систематические группы высшего ранга, его совпадение с характером окраски и чертами строения. Клеточные оболочки водорослей. Бесполое и половое размножение водорослей. Черты сходства и различия желто-зеленых и зеленых водорослей.

реферат , добавлен 09.06.2011


Питание бактерий. Способы поступления питательных веществ в клетку. Классификация бактерий по типам питания, источникам энергии и электронам. Пропионовокислое брожение, его основные участники, их характеристика, использование в народном хозяйстве.

контрольная работа , добавлен 29.11.2010


История и общая характеристика группы, описание ее пород, отличительные особенности и свойства. Окраска собак и принципы ее наследования. Особенности генетики окрасов и других селекционно-важных признаков собак группы "Буль", психические особенности.

дипломная работа , добавлен 20.04.2012


Понятие и механизм функционирования вкусовой сенсорной системы (вкусовой анализатор, орган вкуса). Трансдукция вкусового сигнала и основные нарушения. Обобщение повреждающих агентов. Усовершенствование метода окраска метиленовым синим вкусовых клеток.

Окраска бактерий по Граму имеет важное диагностическое значение. Бактерии, прочно удерживающие окраску по Граму, получили название грамположительных. Бактерии, не окрашивающиеся по Граму, называются грамотрицательными.
Для окраски бактерий по Граму необходимы следующие реактивы.

Смесь в бутылке ставится в термостат на 24 час (можно и больше). Затем краску фильтруют.

В 5 мл дистиллированной воды растворяют йодистый калий, потом добавляют йод (2 г) и доводят объем дистиллированной водой до 300 мл. Раствор Люголя необходимо защищать от света, поэтому его надо хранить в склянках бурого стекла и в прохладном месте. Под влиянием света и тепла образуется йодная кислота и раствор становится негодным для употребления. Проконтролировать раствор Люголя можно при помощи лакмусовой бумажки. Если обнаруживается кислая реакция, то такой раствор надо нейтрализовать двууглекислой содой.
Окраска по Граму производится следующим образом:
- на фиксированный огнем мазок наносят генциан или кристалл-виолет на 0,5–1 мин;
- сливают краску и, не промывая водой, на препарат наливают раствор Люголя на 1 мин до полного почернения мазка;
- сливают люголевский раствор и наливают 95°-ный спирт на 0,5–1 мин, причем препарат надо покачивать и сменять спирт до тех пор, пока он не станет бесцветным; промывают водой;
- дополнительно окрашивают фуксином Пфейфера, сафранином или везувином в течение 2–3 мин.
- сливают краску, промывают водой и высушивают мазок, ставя стекло набок.
Способ окраски по Граму требует точного соблюдения времени при обработке препарата различными жидкостями. Особенно это относится к спирту. При более продолжительном, чем нужно, сроке все бактерии обесцветятся, при недостаточном – препарат окажется перекрашенным. Надо также помнить, что время действия краски, протравы и спирта зависит от толщины мазка: толстый мазок надо дольше красить и дольше обесцвечивать. Неравномерный мазок будет и неравномерно краситься, что может дать повод к неправильному заключению. Все это свидетельствует о необходимости хорошо и уверенно владеть техникой приготовления мазков и их окрашивания. Во избежание ошибок, которые иногда происходят при окраске по Граму, в литературе предлагается внести некоторые видоизменения в методику. В числе их можна назвать методику, предложенную Саватеевым для медицинской практики. Сущность ее заключается в том, что после окраски препарата генциан-виолетом и обработки раствором Люголя применяется отмывка не чистым спиртом, а спиртом с добавлением йода, под действием которого бактерии приобретают постоянный необесцвечивающийся темно-лиловый цвет (спирт по Саватееву – 50 мл спирта + 5 мл 5%-ной йодной настойки).
В литературе описано несколько модификаций методов окраски по Граму, из которых мы приведем лишь некоторые.
1. Окраска мазков по Граму, видоизменнная А. Синевым (1930):
а) на зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристалл-виолета;
б) наносят на бумажку две-три капли воды и оставляют на 2 мин;
в) снимают бумажку и наливают раствор Люголя;
г) обесцвечивают спиртом или ацетоном;
д) докрашивают фуксином Пфейфера.
Мазки получаются четкие и без осадка.
Для приготовления бумажек нарезают длинные полосы фильтровальной бумаги шириной 3 см, окрашивают и развешивают на веревке для просушки. Когда бумага хорошо подсохнет, ее нарезают кусочками по величине предметных стекол, складывают в банки и сохраняют впрок.
2. Модификация метода Грама по Хакеру (1921). Необходимые следующие реактивы:
а) кристаллический фиолетовый Хакера (с щевелевокислым аммонием).
Раствор А – кристаллического фиолетового (90% содержания краски) 2 г, этилового спирта (95%-ного) 20 мл.
Раствор Б – аммония щавелевокислого 0,8 г, дистиллированной воды 80 мл.
Растворы А и Б смешивают;
б) раствор Люголя в модификации Грама (йода кристаллического 1 г, йодистого калия 2 г, воды дистиллированной 300 мл).
в) раствор сафранина для докрашивания: сафранина (2,5% в 95%-ном этиловом спирте) 10 мл, дистиллированной воды 100 мл.
Препараты окрашивают в течение 1 мин кристаллическим фиолетовым (со щавелевокислым аммонием), промывают водопроводной водой не более 2 сек, наливают раствор Люголя и оставляют на 1 мин, затем промывают водой и высушивают. Докрашивают в течение 10 сек раствором сафранина, затем промывают водопроводной водой, высушивают, и исследуют.
3. А. В. Коронный (1959) рекомендует ускоренный метод окраски по Граму – окрашивание генциан-виолетом, обработка 5%-ным раствором фенола и обработка раствором Люголя и докрашивание карболовым фуксином Циля сокращается до 5 сек на каждый процесс. Обесцвечивание спиртом – 15 сек.
4. Окраска по Граму в модификации Г.П. Калины (1961). На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды и вносят в нее минимальное количество бактериальных клеток. Суспензию смешивают с петлей полупроцентного спиртового раствора кристаллического фиолетового, распределяют равномерно по площади 1 см2, подсушивают и фиксируют однократным проведением через пламя. После этого препарат в течение 1 мин обрабатывают следующим реактивом; 5%-ного раствора фуксина 10 мл, 10%-ного раствора йода 10 мл, ацетона 10 мл и 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия 70 мл. Опускают препарат на одно мгновение в этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой.
5. Окраска по Граму в модификации К.М. Бартона (1962). Применение ацетона дает более чистые препараты. Дополнительная окраска фуксином менее эффективна. Наиболее контрастным дополнительным красителем является смесь Сандифорда – 0,05 г малахитового зеленого, 0,15 г пиронина и 100 мл дистиллированной воды.

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки

Студент должен иметь представление.. о механизмах окраски структурных компонентов бактерий клеточной стенки.. работа изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Твитнуть

Все темы данного раздела:

Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с методами приготовления и окрас

Морфология прокариот
Цель:сравнить формы и размеры микроорганизмов на примере кишечной палочки, стафилококка и гриба кандиды (см. теоретическую справку). Самостоятельна

Морфология прокариот
Бактерии - это одноклеточные прокариоты растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Размножение происходит

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска
Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить. 1 этап. О

Методы окраски
Простые методы (ориентировочные) Сложные методы (дифференцирующие) 1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним кр

Окраска по Цилю-Нильсену
Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов,

Окраска по Ожешко
Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым

Окраска по Романовского-Гимза
Методика окраски по Романовскому-Гимзе: Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура. 1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 ка

Самостоятельная работа во внеурочное время
1. Дайте определение: а) морфологические свойства - __________________________________________________ ____________________________________________________________________________

Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70-80 °С).

Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт , ацетон , смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания мазков

1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном , наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.